紫外分光光度法测定蛋白质含量

一、实验目的

   1.学习紫外分光光度计测定蛋白质含量的原理。

   2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

   3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理

    1.紫外-可见分光光度计，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm

可见光：400-780 nm（可被人们的眼睛所感觉）

特点：带光谱、分子光谱

应用：定性分析-zui大吸收波长；

      定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）

a.定性分析原理：

  吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.

  b.定量分析原理：

    根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

    定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c.仪器组成部件:

    各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

   2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：

（1）蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在zui大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

（2）此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。

（3）有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：

               蛋白质浓度（mg/mL）=1.4280-0.74A260

    （A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值）

        还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：

               蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d

 其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子

（4）稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式：

                蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

（A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值

三、仪器与试剂

    仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。

试剂：标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）。

四、实验步骤

   1.基本操作

    （1）启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。

    （2）用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比（参比溶液不可取出）.

    （3）在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描）

    （4）将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。

2.吸收曲线的制作:（找出zui大吸收波长）

     将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的zui大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为0.1984。

   3.标准曲线的制作：

     在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件（测量波长：278.00 nm）。

用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A278，记录如下：

浓度（mg/mL）
 

0.3
 

0.4
 

0.5
 

0.6
 

0.7
 
 

A278
 

0.1971
 

0.2532
 

0.3222
 

0.3758
 

0.4382
 

 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：

    4.样品测定：

      配制三份待测蛋白质溶液，（取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度）按上述方法测定278 nm处的吸光度。得吸光度依次为0.3906，0.3765，0.3848。平均值为A278=0.3840,根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。转换后待测蛋白质溶液的浓度为C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。

五、注意事项

准备工作：

（1）在测量前应把机器预热半小时。

（2）溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。

（3）由于蛋白质的紫外吸收峰常因PH值的改变而改变，故进行样品测定时的PH与标准曲线制作时的PH值一致。

测量工作：

（1）吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。

（2）.在作标准曲线进行定量前一定要选择zui大的吸收波长,确保灵敏度高。

（3）在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。

六、思考题

1. 紫外分光光度法测定蛋白质的方法有何缺点及优点？受哪些因素的影响和限制？

答：优点：方法操作简便、迅速、不需要复杂和昂贵的设备，不消耗样品，测定后仍能回收使用，低浓度的盐和大多数缓冲溶液不干扰测定。

    缺点：准确度和灵敏度差一点。干扰物质多：对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会产生较大干扰

2. 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？

 答：因为核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：

          蛋白质浓度（mg/mL）=1.4280-0.74A260

  （A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值）

  还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：

             蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d